Zwei-Photonen-Metabol-FLIM mit dem Coherent Axon Faserlaser

Die Becker & Hickl GmbH – ein Technologieführer im Bereich der Photonenzählung – hat bereits gezeigt, dass kleine Femtosekunden-Faserlaser als kostengünstige Anregungsquellen für Multiphotonen-Fluoreszenzbildgebungssysteme eingesetzt werden können. Mit einer Wellenlänge von 780 nm, einer Pulsrate von 40 MHz bis 80 MHz und einer durchschnittlichen Leistung von 100 mW bis 500 mW eignen sich die Laser nicht nur für die Anregung von NAD(P)H, sondern auch für eine Vielzahl anderer Fluorophore [1, 2], einschließlich solcher mit extrem kurzer Fluoreszenzlebensdauer [3, 4, 5].

Becker und Hickl wollten daher herausfinden, wie sich der Axon Femtosekunden-Laser bei diesen Anwendungen verhalten würde.

Abb. 1: Coherent Axon Laser

 

Systemarchitektur

Als Testsystem verwendeten sie ein bh DCS-120 MP Multiphotonen-FLIM-System. Die Architektur dieses Systems ist in Abb. 2 dargestellt. 

Der Laserstrahl des Axon wird über einen Freistrahl in den DCS-120-Scankopf eingekoppelt. Im Inneren des Scankopfes wird er von zwei schnellen Galvanometer . Die Linse des Scankopfes projiziert den Laserstrahl in das Mikroskop. Im Inneren des Mikroskops passiert der Strahl einen dichroitischen Strahlteiler und wird auf die hintere Öffnung der Linse projiziert. Die Linse des Mikroskops fokussiert den Strahl in die Bildebene innerhalb der Probe. Wenn der Strahl vom Galvanometer wird, spiegeln die Laser-Rasterscans den Bildbereich in der Probe wider.

 

Für eine maximale räumliche Auflösung ist es wichtig, dass der Laserstrahl die hintere Öffnung der Linse vollständig ausfüllt. Bei den üblichen Brennweiten der Scan- und Rohrlinsen ist dies nicht automatisch der Fall. Der Strahl wird daher um den Faktor 1,5 aufgeweitet, bevor er in den Scanner eintritt. Der Strahldurchmesser in der hinteren Öffnung beträgt etwa 12 mm, was ausreicht, um die Öffnung selbst der größten Mikroskoplinsen auszufüllen. Die Überfüllung der Öffnung ist unproblematisch. Der damit verbundene Verlust an Anregungsleistung kann toleriert werden, da der Laser weit mehr Leistung liefert, als benötigt wird.

Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht wird durch die Linse zurückgeführt und über einen nicht abgetasteten Strahlengang geleitet. L1 und L2 bilden ein Endoskop. Das Endoskop sammelt auch Photonen, die von der Linse nicht perfekt kollimiert werden, z. B. Photonen, die auf dem Weg durch eine dicke Probe gestreut werden. Das Fluoreszenzlicht wird in zwei Wellenlängen aufgeteilt und von zwei bh HPM-100-40-Hybriddetektoren erfasst [6, 7]. Die Einzelphotonenimpulse der Detektoren werden in zwei SPC-180N-TCSPC/FLIM-Modulen aufgezeichnet [1]. Die SPC-180N-Module bestimmen die Erkennungszeiten der Photonen nach den Anregungspulsen und die Position des Scanners im Moment der Photonenerkennung. Diese Informationen werden zur Erstellung der FLIM-Bilder verwendet. Dabei handelt es sich um Pixel-Arrays, wobei jedes Pixel in einer großen Anzahl von Zeitkanälen eine vollständige Fluoreszenzabfallkurve enthält [1].

Das Scannen des Laserstrahls und die Strahlunterdrückung in den Flyback-Phasen werden hardwaremäßig über eine bh GVD-140-Scan-Controller-Karte gesteuert. Die Steuerung der Laserintensität erfolgt über den AOM-Steuersignaleingang des Axon. Dieses Signal wird ebenfalls von der GVD-140-Karte bereitgestellt. Das gesamte System wird von der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware [1] von bh betrieben, die ein vollständig integriertes FLIM-System mit Scannersteuerung, Laser, Datenerfassung und Datenanalyse bietet. Die Benutzeroberfläche des FLIM-Systems ist in Abb. 3 dargestellt.

Abb. 3: Hauptbildschirm der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware

 

Ergebnis

FLIM-Bilder, die mit derAXON aufgenommen wurden, sind in Abb. 4 bis Abb. 6 dargestellt. Für alle Bilder wurde ein 40-faches Objektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 1,3 verwendet. Die Datenanalyse wurde mit der bh SPCImage NG FLIM Data Analysis Suite durchgeführt. Abb. 4 und Abb. 5 zeigen farbcodierte FLIM-Bilder der mittleren (amplitudengewichteten) Lebensdauer und des Stoffwechselindikators a1. Ein Histogramm des ausgewählten Bildparameters (tm oder a1) wird oben rechts angezeigt, eine Abklingkurve an der Cursorposition wird unten rechts angezeigt. Die Abklingparameter am ausgewählten Punkt werden ganz rechts angezeigt.

Abb. 4: Rohhaut, NADH-Bild, amplitudengewichtete mittlere Lebensdauer des doppelt-exponentiellen Zerfalls

 

Abb. 5: Rohhaut, NADH-Bild, Amplitude a1 der Komponente des schnellen Abklingens. a1 ist ein Indikator für den Stoffwechselzustand

 

Abb. 6 zeigt Hefezellen. Der Emissionsfilter wurde für den Nachweis von 440 bis 470 nm ausgewählt, wodurch der Spektralbereich auf den Nachweis von NAD(P)H beschränkt wurde. Die obere Nachweisgrenze von 470 nm mag sehr restriktiv erscheinen. Um den Nachweis von FAD- und FMN-Fluoreszenz zu vermeiden, ist jedoch eine Beschränkung auf weniger als 470 nm erforderlich. Diese Verbindungen werden zusammen mit NAD(P)H angeregt, zeigen jedoch eine unterschiedliche Abhängigkeit vom Stoffwechselzustand. Die Daten wurden mit den MLE-Algorithmen von SPCImage NG analysiert und lieferten hochpräzise, doppelt-exponentielle Zerfallsparameter in den einzelnen Pixeln des Bildes. Das gezeigte Bild zeigt a1, die Amplitude der schnellen Abklingkomponente. Sie stellt die Menge an ungebundenem NAD(P)H dar. Da sich das Verhältnis von gebundenem zu ungebundenem NAD(P)H mit dem Stoffwechsel ändert, wird a1 auch als „metabolischer Indikator“ bezeichnet [1].

 

Wie zu sehen ist, unterscheidet sich a1 in verschiedenen Zellen deutlich. Dies deutet darauf hin, dass der Stoffwechselzustand in verschiedenen Zellen unterschiedlich ist. Ein hoher a1-Wert (blau dargestellt) deutet darauf hin, dass der Stoffwechsel eher glykolytisch ist, ein niedriger a1-Wert (gelb) deutet darauf hin, dass er eher oxidativ ist.

 

„Wir haben gezeigt, dass der Coherent Axon Femtosekunden-Laser in Kombination mit bhs-Präzisionsscanneroptiken, Detektoren, TCSPC-/FLIM-Elektronik und Datenanalysesoftware genaue Informationen über den Stoffwechsel lebender Zellen und Gewebe liefert.“ Dank seiner internen AOM-basierten Intensitätsregelung lässt sich der Laser problemlos in die SPCM-FLIM-Erfassungssoftware von bh integrieren. Die Strahlabschaltung in Strahlstopp-Situationen und Flyback-Phasen des Scanners sowie eine reproduzierbare Intensitätssteuerung schützen die Probe vor lokalen Photodämagen. Insgesamt ist dieAxon aus DCS-120 MP undAxon ein einfach zu bedienendes, hochauflösendes und hochempfindliches Zwei-Photonen-Laser-Scanning-FLIM-Mikroskop. 

 

Referenzen

1. W. Becker, Das bh TCSPC-Handbuch. 10. Auflage. Becker & Hickl GmbH (2023), verfügbar unter www.becker-hickl.com, gedruckte Exemplare erhältlich bei bh
2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, Zwei-Photonen-FLIM mit einem Femtosekunden-Faserlaser. Anwendungshinweis, verfügbar unter www.becker-hickl.com
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, Zwei-Photonen-FLIM von Mpilroom-Sporen enthüllt ultraschnelle Zerfallskomponenten. Anwendungshinweis (2021), verfügbar unter www.becker-hickl.com
4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, Ultraschneller Fluoreszenzabklingvorgang bei natürlichen Carotinoiden. Anwendungshinweis, becker-hickl.com (2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy: Hochauflösendes Multiphotonen-FLIM zeigt ultraschnellen Fluoreszenzabfall im menschlichen Haar. Anwendungshinweis, becker-hickl.com (2023)
6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, FLIM- und FCS-Detektion in Laserscanning-Mikroskopen: Gesteigerte Effizienz durch GaAsP-Hybriddetektoren. Migr. Res. Tech. 74, 804–811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH, IRF-Breite von Hybriddetektoren und MCP-PMTs unter 20 ps. Anwendungshinweis, verfügbar unter www.becker-hickl.com