Zweiphotonen-Metabolismus-FLIM unter Verwendung des Coherent Axon -Faserlasers

Die Becker & Hickl GmbH, ein technologischer Marktführer im Bereich der Photonenzählgeräte, hat bereits früher gezeigt, dass kompakte Femtosekunden-Faserlaser als kostengünstige Anregungsquelle für Multiphotonen-Fluoreszenz-Bildgebungssysteme eingesetzt werden können.Die Laser haben eine Emissionswellenlänge von 780 nm, eine Pulsfrequenz von 40 MHz bis 80 MHz und eine durchschnittliche Leistung von 100 mW bis 500 mW. Sie eignen sich nicht nur zur Anregung von NAD(P)H, sondern auch für eine Vielzahl anderer Fluorophore [1, 2], darunter auch solche mit extrem kurzer Fluoreszenzlebensdauer [3, 4, 5].

Daher möchten Becker & Hickl wissen, Axon Faser-Femtosekundenlaser von Axon in diesen Anwendungen.

Abb. 1:Coherent Axon Femtosekundenlaser

 

Systemarchitektur

Als Testsystem verwendeten sie das Multiphotonen-FLIM-System bh DCS-120 MP. Der Aufbau des Systems ist in Abbildung 2 dargestellt. 

Der Laserstrahl des Axon Lasers wird als freier Strahl in den DCS-120-Scankopf eingekoppelt.Im Inneren des Scankopfes wird er von zwei schnellen Galvanometern abgelenkt. Die Scankopf-Scansichtlinse projiziert den Laserstrahl in das Mikroskop. Im Inneren des Mikroskops durchläuft der Strahl einen dichroitischen Strahlteiler und wird auf die hintere Öffnung der Mikroskoplinse projiziert. Das Objektiv des Mikroskops fokussiert den Strahl auf die Bildebene im Inneren der Probe. Während der Strahl von den Galvanometern abgelenkt wird,erfolgt die fokussierte Gitterabtastung des Lasers über dem Bildbereich in der Probe.

 

Um eine maximale räumliche Auflösung zu erzielen, muss der Laserstrahl die hintere Apertur der Mikroskoplinse vollständig ausfüllen. Bei den üblichen Brennweiten von Abtast- und Tubuslinsen ist dies nicht automatisch der Fall.Daher wird der Strahl vor dem Eintritt in den Scanner um das 1,5-Fache aufgeweitet. Der Strahldurchmesser in der hinteren Apertur beträgt etwa 12 mm, was ausreicht, um selbst die Apertur der größten Mikroskopobjektive auszufüllen. Eine Überfüllung der Mikroapertur ist unproblematisch. Die damit verbundenen Verluste an Anregungsleistung sind tolerierbar, da die vom Laser gelieferte Leistung die benötigte Leistung bei weitem übersteigt.

Die von der Probe emittierte Fluoreszenz wird von der Mikroskoplinse zurückreflektiert und anschließend über einen nicht-abtastenden Strahlengang weitergeleitet. L1 und L2 bilden ein Teleskop. Das Teleskop fängt zudem Photonen ein, die von der Mikroskoplinse nicht vollständig kollimiert wurden, beispielsweise solche, die außerhalb der dicken Probe gestreut wurden. Die Fluoreszenz wird in zwei Wellenlängenbereiche aufgeteilt und von zwei bh HPM-100-40-Mischdetektoren erfasst [6, 7]. Die Einzelphotonenimpulse der Detektoren werden in zwei SPC-180N-TCSPC/FLIM-Modulen aufgezeichnet [1]. Die SPC-180N-Module bestimmen den Zeitpunkt der Photonendetektion nach dem Anregungsimpuls sowie die Position des Scanners zum Zeitpunkt der Photonendetektion. Diese Informationen werden zur Erstellung von FLIM-Bildern verwendet. Dabei handelt es sich um Pixelarrays, wobei jedes Pixel eine vollständige Fluoreszenzabklingkurve über eine große Anzahl von Zeitkanälen enthält [1].

Die Abtastung des gegenphasigen Laserstrahls und die Strahlunterdrückung werden hardwaremäßig von der bh GVD-140-Abtaststeuerungskarte gesteuert. Die Steuerung der Laserintensität erfolgt über den AOM-Steuersignaleingang Axon . Dieses Signal wird ebenfalls von der GVD-140-Karte bereitgestellt. Das gesamte System wird von der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware von bh 【1】 betrieben und bietet ein vollständig integriertes FLIM-System mit Funktionen zur Scannersteuerung, Lasersteuerung, Datenerfassung und Datenanalyse. Die Benutzeroberfläche des FLIM-Systems ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Hauptfenster der SPCM-Software zur Datenerfassung und Steuerung

 

Ergebnis

Die mitAXON FLIM-Bilder sind in den Abbildungen 4 bis 6 dargestellt. Alle Bilder wurden mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv (NA = 1,3) aufgenommen. Die Datenanalyse erfolgte mit dem bh SPCImage NG FLIM-Datenanalysepaket.Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen farbcodierte FLIM-Bilder der mittleren (amplitudengewichteten) Lebensdauer und des Stoffwechselindikators a1. Oben rechts ist ein Histogramm der ausgewählten Bildparameter (tm oder a1) dargestellt, unten rechts die Abklingkurve an der Cursorposition. Die Abklingparameter des ausgewählten Bildausschnitts werden ganz rechts angezeigt.

Abb. 4: Schweinehaut, NADH-Bild, amplitudengewichtete mittlere Lebensdauer bei doppelt exponentieller Abklingkurve

 

Abb. 5: Schweinehaut, NADH-Bild, Amplitude, a1, schnell abklingende Komponente. a1 ist ein Indikator für den Stoffwechselzustand.

 

Abbildung 6 zeigt Hefezellen. Es wurde ein Emissionsfilter gewählt, der den Bereich von 440 bis 470 nm erfasst, wodurch der Spektralbereich auf die Detektion von NAD(P)H beschränkt wird. Die Obergrenze von 470 nm mag sehr streng erscheinen. Um jedoch die Detektion der Fluoreszenz von FAD und FMN zu vermeiden, muss die Grenze bei 470 nm liegen. Diese Verbindungen werden ebenso wie NAD(P)H angeregt, zeigen jedoch eine unterschiedliche Abhängigkeit vom Stoffwechselzustand. Die Daten werden mittels des MLE-Algorithmus von SPCImage NG analysiert, der für jeden Bildpixel hochpräzise Parameter für die doppelt-exponentielle Abklingkurve liefert. Das gezeigte Bild stellt a1 dar, also die Amplitude der schnell abklingenden Komponente. Sie gibt die Menge an ungebundenem NAD(P)H an. Da sich das Verhältnis von gebundenem zu freiem NAD(P)H mit dem Stoffwechsel verändert, wird a1 auch als „Stoffwechselindikator“ bezeichnet [1].

 

Es ist ersichtlich, dass sich a1 in den verschiedenen Zellen deutlich unterscheidet. Dies deutet darauf hin, dass der Stoffwechselzustand in den verschiedenen Zellen unterschiedlich ist. Ein hoher a1-Wert (blau dargestellt) steht für einen stärker glykolytisch geprägten Stoffwechsel, während ein niedriger a1-Wert (gelb) auf einen stärker oxidativen Stoffwechsel hindeutet.

 

„Wir haben gezeigt, dassCoherent Axon Coherent in Kombination mit den präzisen Scanneroptiken, Detektoren, TCSPC-/FLIM-Elektronikkomponenten und der Datenanalysesoftware von bh genaue Informationen über den Stoffwechsel lebender Zellen und Gewebe liefert.“ Dank der integrierten, auf AOM basierenden Intensitätssteuerung lässt sich der Laser nahtlos in die SPCM-FLIM-Erfassungssoftware von bh integrieren. Durch die Strahlunterdrückung bei Strahlunterbrechung und während der Rücklaufphase des Scanners sowie durch die reproduzierbare Intensitätssteuerung wird die Probe vor lokaler Lichtschädigung geschützt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das DCS-120 MP / Axon -Kombination ein benutzerfreundliches, hochauflösendes und hochempfindliches Zwei-Photonen-Laser-Scan-FLIM-Mikroskop. 

 

Literaturverzeichnis

1. W. Becker, bh TCSPC-Handbuch. 10. Auflage. Becker & Hickl GmbH (2023), abrufbar unter www.becker-hickl.com, gedruckte Exemplare sind bei bh erhältlich
2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz: Zwei-Photonen-FLIM mit Femtosekunden-Faserlaser. Anwendungshinweise, abrufbar unter www.becker-hickl.com
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann: Zwei-Photonen-FLIM an Pilzsporen enthüllt ultrakurze Zerfallskomponenten. Anwendungsbericht (2021), abrufbar unter: www.becker-hickl.com
4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, Ultrakurze Fluoreszenzabklingzeiten in natürlichen Carotinoiden. Anwendungshinweise, www.becker-hickl.com (2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy: Hochauflösende Multiphotonen-FLIM-Messungen enthüllen ultraschnelle Fluoreszenzabklingvorgänge im menschlichen Haar. Anwendungsbericht, www.becker-hickl.com (2023)
6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, FLIM- und FCS-Laserscanning-Mikroskopie: GaAsP-Hybriddetektoren steigern die Effizienz. Micr. Res. Technol. 74, 804–811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH: IRF-Breite von unter 20 ps bei Mischdetektoren und MCP-PMTs. Anwendungshinweise sind unter www.becker-hickl.com verfügbar.