Zweiphotonen-Metabolismus-FLIM mit einem Coherent Axon

Die Becker & Hickl GmbH, ein technologischer Vorreiter im Bereich der Photonenzählgeräte, hat bereits zuvor gezeigt, dass kompakte Femtosekunden-Faserlaser als kostengünstige Anregungsquelle für Multiphotonen-Fluoreszenz-Bildgebungssysteme eingesetzt werden können. Laser mit einer Emissionswellenlänge von 780 nm, einer Pulsrate von 40 MHz bis 80 MHz und einer Durchschnittsleistung von 100 mW bis 500 mW eignen sich nicht nur zur Anregung von NAD(P)H, sondern auchauch für verschiedene andere Fluorophore [1, 2] mit sehr kurzer Fluoreszenzlebensdauer [3, 4, 5] geeignet.

Aus diesem Grund interessierten sich Becker und Hickle dafür,wieAxonbeiAxonAnwendungen funktioniert.

Abb. 1:Coherent Axon

 

Systemarchitektur

Als Testsystem wurde das bh DCS-120 MP Multiphotonen-FLIM-System verwendet. Die Architektur dieses Systems ist in Abbildung 2 dargestellt. 

Der Laserstrahl des Axon wird über einen Freistrahl in den DCS-120-Scankopf eingekoppelt. Im Scankopf wird er von zwei Hochgeschwindigkeits-Galvanometerspiegeln abgelenkt.Die Scanlinse des Scankopfes projiziert den Laserstrahl in das Mikroskop. Im Mikroskop durchläuft der Strahl einen dichroitischen Strahlteiler und wird auf die hintere Öffnung der Mikroskoplinse projiziert. Das Objektiv des Mikroskops fokussiert den Strahl auf die Bildebene innerhalb der Probe.Wenn der Strahl durch das Galvanometer abgelenkt wird, wird der Laserfokus-Raster-Scan auf den Bildbereich innerhalb der Probe gespiegelt.

 

Um die maximale räumliche Auflösung zu erzielen, ist es wichtig, dass der Laserstrahl die hintere Apertur der Mikroskoplinse vollständig ausfüllt. Bei den üblichen Brennweiten von Scanner- und Tubuslinsen wird dies nicht automatisch erreicht.Daher wird der Strahl vor dem Eintritt in den Scanner um das 1,5-Fache vergrößert. Der Strahldurchmesser an der hinteren Öffnung beträgt etwa 12 mm und reicht aus, um die Öffnung selbst der größten Mikroskopobjektive auszufüllen. Eine Überfüllung der Öffnung ist unproblematisch. Da der Laser mehr Leistung liefert als erforderlich, sind Verluste bei der Anregungsleistung akzeptabel.

Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht wird durch die Mikroskoplinsen gesammelt und über einen nicht ablenkenden Strahlengang weitergeleitet. L1 und L2 bilden ein Periskop. Außerdem werden auch Photonen erfasst, die von den Mikroskoplinsen nicht vollständig kollimiert werden, beispielsweise solche, die auf ihrem Weg durch die dicke Probe gestreut werden.Das Fluoreszenzlicht wird in zwei Wellenlängenbereiche aufgeteilt und von zwei HPM-100-40-Hybriddetektoren erfasst [6, 7]. Die Einzelphotonenimpulse der Detektoren werden von zwei SPC-180N-TCSPC/FLIM-Modulen aufgezeichnet [1].Die SPC-180N-Module bestimmen die Detektionszeit der Photonen nach dem Anregungsimpuls sowie die Position des Scanners zum Zeitpunkt der Photonendetektion. Diese Informationen werden zur Erstellung von FLIM-Bildern verwendet. Dabei handelt es sich um Pixel-Arrays, wobei jedes Pixel eine vollständige Fluoreszenzabklingkurve über zahlreiche Zeitkanäle enthält [1].

Das Scannen und das Ausblenden des Laserstrahls in der Rücklaufphase werden durch die bh GVD-140-Scan-Controller-Karte hardwaremäßig gesteuert.Die Steuerung der Laserintensität erfolgt über den AOM-Steuersignaleingang des Axon-Lasers. Dieses Signal wird ebenfalls von der GVD-140-Karte bereitgestellt. Das gesamte System wird von der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware [1] von bh betrieben und bietet ein vollständig integriertes FLIM-System mit Scannersteuerung, Lasersteuerung, Datenerfassung und Datenanalyse. Die Benutzeroberfläche des FLIM-Systems ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Hauptfenster der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware

 

Ergebnis

Die mit der Kombination aus DCS-120 und AXON aufgenommenen FLIM-Bilder sind in den Abbildungen 4 bis 6 dargestellt. Für alle Bilder wurde ein Ölimmersionsobjektiv mit 40-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur (NA) von 1,3 verwendet. Die Datenanalyse erfolgte mit der bh SPCImage NG FLIM-Datenanalysesuite. Die Abbildungen 4 und 5 zeigen farbcodierte FLIM-Bilder der mittleren (amplitudengewichteten) Lebensdauer und des Stoffwechselindikators a1.Das Histogramm des ausgewählten Bildparameters (tm oder a1) wird oben rechts angezeigt, die Abklingkurve an der Cursorposition unten rechts. Die Abklingparameter des ausgewählten Spots werden ganz rechts angezeigt.

Abb. 4: Schweinehaut, NADH-Bild, mittlere Lebensdauer der doppelt-exponentiellen Abklingkurve bei amplitudengewichteter Auswertung

 

Abb. 5: Schweinehaut mit schnell abklingender Komponente, NADH-Bild, Amplitude, a1. a1 ist ein Indikator für den Stoffwechselzustand.

 

Abbildung 6 zeigt Hefezellen. Der Lumineszenzfilter wurde für die Detektion im Bereich von 440 bis 470 nm ausgewählt, wodurch der Spektralbereich auf die Detektion von NAD(P)H beschränkt wurde. Die Detektionsgrenze von 470 nm mag sehr restriktiv erscheinen. Um jedoch die Detektion von FAD- und FMN-Fluoreszenz zu vermeiden, muss die Grenze unterhalb von 470 nm liegen. Diese Verbindungen werden zwar zusammen mit NAD(P)H angeregt, ihre Abhängigkeit vom metabolischen Zustand ist jedoch unterschiedlich. Die Daten werden durch den MLE-Algorithmus von SPCImage NG analysiert, der für jeden einzelnen Bildpixel hochpräzise Parameter für die doppelt exponentielle Abklingkurve liefert.Die Abbildung zeigt a1, die Amplitude der schnell abklingenden Komponente. Diese steht für die Menge an ungebundenem NAD(P)H. Da sich das Verhältnis von gebundenem zu ungebundenem NAD(P)H je nach Stoffwechselzustand ändert, wird a1 auch als „Stoffwechselindikator“ bezeichnet.

 

Wie Sie sehen können, unterscheidet sich a1 deutlich von Zelle zu Zelle. Dies zeigt, dass der Stoffwechselzustand von Zelle zu Zelle variiert. Ein hoher a1-Wert (blau dargestellt) deutet auf einen eher glykolytischen Stoffwechsel hin. Ein niedriger a1-Wert (gelb) deutet auf einen eher oxidativen Stoffwechsel hin.

 

„Durch die KombinationAxon Coherent Axon der präzisen Scanneroptik, den Detektoren, der TCSPC-/FLIM-Elektronik und der Datenanalysesoftware von bh konnten wir nachweisen, dass sich damit genaue Informationen über den Stoffwechsel lebender Zellen und Gewebe gewinnen lassen.“Dank der internen AOM-basierten Intensitätssteuerung lässt sich der Laser nahtlos in die SPCM-FLIM-Erfassungssoftware von bh integrieren. Durch die Strahlunterbrechung bei Beam-Stop-Zuständen sowie die Strahlunterbrechung in der Scanner-Flyback-Phase und die reproduzierbare Intensitätssteuerung wird die Probe vor lokaler Lichtschädigung geschützt.Die KombinationAxon DCS-120 MP undAxon ergibt ein benutzerfreundliches, hochauflösendes und hochempfindliches Zwei-Photonen-Laser-Scanning-FLIM-Mikroskop. 

 

Quellenangaben

1. W. Becker, Das TCSPC-Handbuch. 10. Auflage. Becker & Hickl GmbH (2023), www.becker-hickl.com. 
2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, Zwei-Photonen-FLIM mit Femtosekunden-Faserlaser. Anwendungshinweise, www.becker-hickl.com
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann: „Two-Photon FLIM of Mushroom Spores“ deckt ultraschnelle Abklingkomponenten auf. Anwendungshinweis (2021), www.becker-hickl.com
4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, Ultraschnelle Fluoreszenzabklingkurven natürlicher Carotinoide. Anwendungshinweis, www.becker-hickl.com (2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy, „Hochauflösendes Multiphotonen enthüllt den ultraschnellen Fluoreszenzabklingvorgang im menschlichen Haar“. Anwendungshinweis, www.becker-hickl.com (2023)
6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub: FLIM- und FCS-Detektion bei Laser-Rastermikroskopen: Effizienzsteigerung durch GaAsP-Hybriddetektoren. Micr. Res. Technol. 74, 804–811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH, IRF-Breite unter 20 ps bei Hybriddetektoren und MCP-PMTs. Anwendungshinweis, www.becker-hickl.com