Zweiphotonen-Metabolismus-FLIM unter Verwendung des Coherent Axon Faserlasers

Die Becker & Hickl GmbH, ein technologischer Marktführer im Bereich der Photonenzählgeräte, hat bereits zuvor gezeigt, dass kompakte Femtosekunden-Faserlaser als kostengünstige Anregungsquelle für Multiphotonen-Fluoreszenz-Bildgebungssysteme eingesetzt werden können. Laser mit einer Emissionswellenlänge von 780 nm, einer Pulsfrequenz von 40 MHz bis 80 MHz und einer durchschnittlichen Leistung von 100 mW bis 500 mW eignen sich nicht nur für die NAD(P)H-Anregung, sondern auch für eine Vielzahl anderer Fluorophore, einschließlich solcher mit sehr kurzer Fluoreszenzlebensdauer [1, 2] [3, 4, 5].

Daher stellen Becker & Hickl fest, Axon wussten, welche Leistung der Femtosekunden-Faserlaser von Axon in diesen Anwendungsbereichen erbringen würde.

Abbildung 1: Coherent Axon Femtosekundenlaser

 

Systemarchitektur

Als Testsystem wurde das Mehrphotonen-FLIM-System bh DCS-120 MP verwendet. Der Aufbau dieses Systems ist in Abbildung 2 dargestellt. 

Der Laserstrahl des Axon wird als freier Strahl in den DCS-120-Scankopf eingekoppelt. Im Inneren des Laserscankopfes wird der Strahl von zwei Hochgeschwindigkeits-Galvanometerspiegeln abgelenkt. Die Scanlinsen des Scankopfes projizieren den Laserstrahl in das Mikroskop. Im Inneren des Mikroskops durchläuft der Strahl einen dichroitischen Strahlteiler und wird auf die hintere Blende des Mikroskopobjektivs projiziert. Das Mikroskopobjektiv fokussiert den Strahl auf die Bildebene innerhalb der Probe. Wenn der Strahl durch den Detektor abgelenkt wird, wird ein Raster-Scan des Laserfokus über den Bildbereich der Probe erzeugt.

 

Um die räumliche Auflösung zu maximieren, ist es wichtig, dass der Laserstrahl die hintere Blende der Mikroskoplinse vollständig ausfüllt. Aufgrund der üblichen Brennweiten von Scan- und Tubuslinsen ist dies nicht automatisch der Fall. Daher wird der Strahl vor dem Eintritt in den Scanner um das 1,5-Fache aufgeweitet. Der Strahldurchmesser innerhalb der hinteren Blende beträgt etwa 12 mm, was ausreicht, um die Blende der größten Mikroskoplinse auszufüllen. Eine übermäßige Ausfüllung der Blende stellt kein Problem dar. Da der Laser weit mehr Leistung liefert, als erforderlich ist, sind die damit verbundenen Leistungsverluste vertretbar.

Die von der Probe ausgehende Fluoreszenz wird durch die Mikroskoplinsen wieder aufgefangen und über einen nicht-schnittfreien Strahlengang weitergeleitet. L1 und L2 bilden ein Periskop. Das Periskop fängt zudem Photonen auf, die nicht vollständig auf die Mikroskoplinsen ausgerichtet sind. So werden beispielsweise auch Photonen erfasst, die auf ihrem Weg durch eine dicke Probe gestreut wurden. Das Fluoreszenzlicht wird in zwei Wellenlängenbereiche aufgeteilt und von zwei bh HPM-100-40-Hybriddetektoren erfasst [6, 7]. Die Einzelphotonenimpulse der Detektoren werden von zwei SPC-180N-TCSPC/FLIM-Modulen aufgezeichnet [1]. Die SPC-180N-Module bestimmen die Detektionszeit der Photonen nach dem Anregungsimpuls sowie die Position des Scanners zum Zeitpunkt der Photonendetektion. Diese Informationen werden zur Erstellung eines FLIM-Bildes verwendet. Dabei handelt es sich um ein Pixelarray, wobei jedes Pixel die gesamte Fluoreszenzabklingkurve über viele Zeitkanäle enthält [1].

Das Scannen des Laserstrahls und die Strahlunterdrückung in der Rücklaufphase werden über die Scan-Controller-Karte GVD-140 von bh hardwaremäßig gesteuert. Die Steuerung der Laserintensität erfolgt über den AOM-Steuersignaleingang Axon . Dieses Signal wird auch von der GVD-140-Karte bereitgestellt. Das gesamte System wird von der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware[1] von bh betrieben und bietet ein vollständig integriertes FLIM-System mit Scannersteuerung, Lasersteuerung, Datenerfassung und Datenanalyse. Die Benutzeroberfläche des FLIM-Systems ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Hauptfenster der SPCM-Datenerfassungs- und Steuerungssoftware

 

Ergebnis

DieAXON aufgenommenen FLIM-Bilder sind in Abbildung 4 bis Abbildung 6 dargestellt. Für alle Bilder wurde ein 40-fach-Objektiv mit NA = 1,3 verwendet. Die Datenanalyse erfolgte mit der bh SPCImage NG FLIM-Datenanalyse-Software. Abbildung 4 und Abbildung 5 zeigen farbcodierte FLIM-Bilder der mittleren (amplitudengewichteten) Lebensdauer und des Stoffwechselindikators a1. Das Histogramm des ausgewählten Bildparameters (tm oder a1) wird oben rechts angezeigt, und die Abklingkurve an der Cursorposition wird unten rechts angezeigt. Die Abklingparameter des ausgewählten Punktes werden ganz rechts angezeigt.

Abbildung 4: Schweinehaut, NADH-Bild, amplitudengewichtete mittlere doppelexponentiale Zerfallszeit

 

Abbildung 5: Schweinehaut mit schnell abklingenden Komponenten, NADH-Bild, Amplitude, a1. a1 ist ein Indikator für den Stoffwechselzustand.

 

Abbildung 6 zeigt Hefezellen. Da der Emissionsfilter für die Detektion im Bereich von 440 nm bis 470 nm ausgewählt wurde, beschränkt sich der Spektralbereich auf die Detektion von NAD(P)H. Die obere Detektionsgrenze bei 470 nm mag sehr restriktiv erscheinen. Um jedoch die Detektion von FAD- und FMN-Fluoreszenz zu verhindern, muss die Grenze unter 470 nm liegen. Diese Verbindungen werden zwar zusammen mit NAD(P)H angeregt, zeigen jedoch je nach Stoffwechselzustand unterschiedliche Verhaltensweisen. Durch die Analyse der Daten mit dem MLE-Algorithmus von SPCImage NG wurden hochpräzise Parameter für die doppelte Exponentialabklingkurve für einzelne Bildpixel bereitgestellt. Das dargestellte Bild zeigt a1, die Amplitude der schnell abklingenden Komponente. Sie gibt die Menge an ungebundenem NAD(P)H an. Da sich das Verhältnis von gebundenem zu ungebundenem NAD(P)H je nach Stoffwechselzustand ändert, wird a1 auch als „Stoffwechselindikator“ bezeichnet [1].

 

Wie man sieht, unterscheidet sich a1 deutlich von Zelle zu Zelle. Dies deutet darauf hin, dass der Stoffwechselzustand von Zelle zu Zelle unterschiedlich ist. Ein hoher a1-Wert (blau dargestellt) weist auf einen stärker glykolytischen Stoffwechsel hin, während ein niedriger a1-Wert (gelb) einen eher oxidativen Stoffwechsel anzeigt.

 

„DerCoherent Axon Femtosekunden-Faserlaser hat sich in Kombination mit den Präzisionsscanner-Optiken, Detektoren, TCSPC-/FLIM-Elektronikmodulen und der Datenanalysesoftware von bh als zuverlässige Quelle für präzise Informationen über den Stoffwechsel lebender Zellen und Gewebe erwiesen.“ Durch die interne AOM-basierte Intensitätssteuerung lässt sich der Laser nahtlos in die SPCM-FLIM-Erfassungssoftware von bh integrieren. Bei angehaltenem Strahl schützen Strahlunterbrechung, Scanner-Flyback-Phase und reproduzierbare Intensitätssteuerung die Probe vor lokaler Lichtschädigung. Insgesamt ist die Kombination aus DCS-120 MP undAxon ein benutzerfreundliches, hochauflösendes und hochempfindliches 2-Photonen-Laser-Scanning-FLIM-Mikroskop. 

 

Literaturverzeichnis

1. W. Becker, Das bh TCSPC-Handbuch. 10. Auflage. Becker & Hickl GmbH (2023), verfügbar unter www.becker-hickl.com, die gedruckte Ausgabe ist bei bh erhältlich
2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, Zwei-Photonen-FLIM mit Femtosekunden-Faserlaser. Anwendungshinweise, siehe www.becker-hickl.com
3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, „Aufdeckung von Zwei-Photonen-FLIM- und ultraschnellen Abklingkomponenten bei Pilzsporen“. Anwendungshinweis (2021), abrufbar unter www.becker-hickl.com
4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, Ultraschnelle Fluoreszenzabklingzeiten natürlicher Carotinoide. Anwendungshinweise, www.becker-hickl.com (2022)
5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy, Hochauflösendes Multiphotonen-FLIM: Aufschluss über den ultraschnellen Fluoreszenzabklingprozess in menschlichem Haar. Anwendungshinweise, www.becker-hickl.com (2023)
6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub: FLIM- und FCS-Detektion in Laserscanning-Mikroskopen: Effizienzsteigerung durch GaAsP-Hybriddetektoren. Micr. Res. Technol. 74, 804–811 (2011)
7. Becker & Hickl GmbH, Hybriddetektoren und MCPSub-20ps-IRF-Spektren. Anwendungshinweise, siehe www.becker-hickl.com