Dartmouth College

Herausforderung

达特茅斯学院 Michael Hoppa 教授实验室的基础研究可以帮助治疗癫痫和其他与遗传相关的神经性疾病。 众所周知，这些疾病与构成大脑的复杂神经元网络中出现错误信号（突触功能障碍）有关。 他说：“我们研究的是遗传疾病对动作电位 (AP) 和相关化学物质释放有怎样的影响，这是所有神经元的基本信号传导机制。 我们正在以亚微米空间分辨率和远低于一毫秒的时间分辨率对此进行详细调查。”空间分辨率使在小轴突（直径 <200 nm）以及其他亚细胞成分中跟踪 AP 事件成为可能。 他们希望自己的见解可以帮助改善治疗效果。 

Michael erklärte, dass sein Team molekularbiologische Methoden einsetzt, um die Gene dieser Erkrankungen zu manipulieren, und dabei in der physiologischen und pharmakologischen Forschung sowohl optogenetische Techniken als auch quantitative Fluoreszenzmikroskopie kombiniert. Der rhodopsinartige fluoreszierende Spannungsindikator ist ein wichtiges Werkzeug, um direkt auf das grundlegende Signal (AP) zu fokussieren, anstatt langsamere Sekundärsignale wie Kalziumfluoreszenz zu verfolgen. Die Qualität der Daten hängt in hohem Maße von den Lasern ab, die zur Anregung der Indikatoren und zur Bildgebung verwendet werden, sowie von der Leistungsfähigkeit der anderen in der Arbeit eingesetzten Proben. Sie benötigen mehrere Laserwellenlängen, um die verschiedenen in der Studie verwendeten Proben selektiv anzuregen. Michael fügt hinzu: „Wir streben stets nach einer Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses, also der Photonen, was bedeutet, dass wir eine Ausgangsleistung von 50 bis 150 mW benötigen, je nach der spezifischen Leuchtkraft der jeweiligen Probe.“

Lösung

Zu Beginn dieses Projekts benötigte Michael einen 637-nm-Laser mit einer Leistung von 150 mW.Coherent , prüfte er verschiedene Laser und nannte mehrere Gründe für seine Wahl: „Für den Großteil unserer Arbeit ist es entscheidend, dass der Laser eine schnelle analoge Modulation und sehr stabile Ausgangseigenschaften aufweist. Von den Lasern, die wir getestet haben, war der OBIS-Laser der einzige, der während des Impulses keine nachweisbare Verzögerung aufwies und eine sehr stabile Leistung lieferte.“ Er erklärte, dass dies unbedingt erforderlich sei, da die Reaktionszeit der Spannungsanzeige nur wenige hundert Mikrosekunden betrage. Daher benötige sein Team schnelle Modulation und schnelle Anstiegs- und Abfallzeiten, um diese Zeitauflösung zu nutzen und die zeitlichen Details der AP-Erzeugung zu beobachten – was von entscheidender Bedeutung sei. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass kurze Rechteckimpulse (z. B. 400 µs) die Gesamtlichtmenge, der die abgetrennten lebenden Neuronen ausgesetzt sind, so weit wie möglich reduzieren. (Er berichtet, dass sie zu Beginn ihrer Arbeit eine überraschende Entdeckung machten: Wenn sie jeglicher Art von kontinuierlicher Lichteinstrahlung ausgesetzt sind, sterben Neuronen im Gehirn von Säugetieren sehr schnell ab. Natürlich befinden sich diese Neuronen normalerweise in einer völlig dunklen Umgebung innerhalb des Schädels.)

Die Stimulation der Neuronen erfolgt in der Regel über eine kleine Platinelektrode. Seit 2017 kombiniert das Team zudem optische Methoden mit der Patch-Clamp-Technik, wodurch ihre Daten um eine weitere Dimension erweitert werden. Das Team verfügt nun über insgesamt 12 OBIS-Laser, die den Großteil des sichtbaren Spektrums abdecken. Um zu verstehen, wie die Ausgangssignale mehrerer OBIS-Laser im Mikroskop kombiniert werden, kann man sich das spannende Video „Game of Photons“ ansehen, das das Team erstellt hat. Die Bedienung über Touchscreen und ein einziges Bedienfeld ist sehr einfach: Ausgelöst durch Impulse von einem Arduino-Chip, der die gesamte Experimentsequenz steuert, mit einer Geschwindigkeit von bis zu 2000 Bildern pro Sekunde. Michael wies außerdem auf die hervorragende Zuverlässigkeit dieser Laser hin; einige davon sind bereits seit über sieben Jahren im Einsatz, ohne dass dabei Leistungseinbußen aufgetreten wären. 

Ergebnisse

Das Hoppa-Team hat auf der Grundlage dieser Technologien mehrere Artikel veröffentlicht, die sich mit den von ihnen angewandten Methoden und den Fortschritten bei den Sonden selbst befassen und neue Details zur Funktionsweise verschiedener spannungsgesteuerter Ionenkanäle aufzeigen. Michael sagt: „Ich bin überzeugt, dass wir hervorragende Fortschritte dabei erzielt haben, die Organisation, Funktion und das therapeutische Potenzial von Ionenkanälen und ihren Bindungspartnern in Axonen und Synapsen für die Steuerung des Informationsflusses im Gehirn zu bestimmen.“ Sein Forschungsteam wächst stetig und sucht derzeit nach Doktoranden und Postdoktoranden. Michaels ansteckende Begeisterung für die Wissenschaft ist die treibende Kraft, die dieses Team vorantreibt. „Mein Traumlabor ist voller Laser, Platinelektroden, unzähliger Neuronen und Gliazellen sowie einer Fülle von fluoreszierenden Proteinen.“ Wir freuen uns, dass er sich für ein Forschungsgebiet mit großem therapeutischem Potenzial entschieden hat, und fühlen uns geehrt, dass er unsere Laser als Teil seines Traumlabors ausgewählt hat. 

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