Staatliche Universität von New Mexico: Zeitaufgelöste Durchflusszytometrie

Herausforderung

Das Forschungsteam von Professorin Jessica Houston an der New Mexico State University untersuchte, wie zeitaufgelöste Messungen auf einzigartige Weisein der Durchflusszytometrieeingesetzt werden können. Ein wichtiger Schwerpunkt des Forschungsteams liegt auf der Erstellung von Stoffwechselprofilen von Krebszellen, d. h. der Bewertung der Vitalität von Krebszellen unter Einwirkung von Chemotherapeutika mittels Fluoreszenzlebensdauer-Messungen. Eine weitere wichtige Anwendung ist die gezielte Untersuchung grundlegender zellulärer Signalwege und Rezeptoraktivitäten unter Verwendung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) und fluoreszierenden Proteinen.

Houston wies darauf hin, dass sich die zeitaufgelöste Durchflusszytometrie deutlich von den meisten bestehenden Anwendungen der Durchflusszytometrie unterscheidet, die sich bei der Durchführung von Zähl- und Sortierfunktionen auf Daten zur stationären Fluoreszenzintensität stützen. Die im Handel erhältlichen Durchflusszytometer, die für stationäre Daten optimiert sind, eigneten sich jedoch nicht für ihre Forschung. Daher musste ihr Team zunächst ein eigenes Durchflusszytometer entwickeln.

Es gibt zwei bekannte Methoden zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer: im Zeitbereich oder im Frequenzbereich unter Verwendung eines gepulsten Lasers oder einer anderen Lichtquelle. Houston erklärt: „Wir benötigen einen Hochdurchsatz-Durchflusszytometer, um eine große Anzahl von Zellen zerstörungsfrei zu zählen und/oder zu sortieren, beispielsweise zur Untersuchung von metastasierenden Krebszellen im Blut. Zeitbereichsmessungen mit Photonenzählung können den erforderlichen Durchsatz jedoch nicht gewährleisten. Deshalb haben wir uns für den Frequenzbereich entschieden, wo die etablierte Methode darin besteht, den Anregungslaser zu modulieren und dies mit der Phasenverschiebung der beobachteten modulierten Fluoreszenzemission zu korrelieren.“

Lösung

Neben der Beobachtung der endogenen Fluoreszenz von Metaboliten wie NADH und FAD möchte das Team um Houston in seiner Arbeit auch eine Vielzahl unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoffe einsetzen. Daher benötigen sie mehrere Laserwellenlängen, um all diese verschiedenen Zielmoleküle effektiv anzuregen. Außerdem benötigen sie Laser mit guter Strahlqualität (d. h. niedrigem M2-Wert) sowie einer hohen Ausgangsstabilität hinsichtlich Strahlausrichtung und Leistungsrauschen.

Nach sorgfältiger Prüfung entschieden sie sich für den Einsatz von Coherent OBIS-Lasern. Houston erklärte: „Wir verwenden derzeit mehrere OBIS-Laser mit Wellenlängen von 375 nm, 405 nm, 488 nm und 633 nm. Diese intelligenten Laser eignen sich hervorragend für unsere Arbeit. Neben der hohen Ausgangsqualität ermöglichen sie uns eine schnelle und direkte digitale Modulation bei der Arbeit, und das Ein- und Ausbauen dieser Plug-and-Play-Laser ist sehr einfach, da sie alle die gleichen Abmessungen haben.“ Sie wies darauf hin, dass ein weiterer wichtiger Vorteil des OBIS darin besteht, dass er eine Ausgangsleistung von mehreren zehn oder sogar mehreren hundert Milliwatt liefern kann. Dies liegt daran, dass viele ihrer Experimente auf Messungen der Lebensdauer im Frequenzbereich basieren, bei denen die digitale Modulation die Laserleistung an der Durchflusszelle um bis zu 50 % reduzieren kann.

Ergebnisse

Houston erklärte, dass sich ihr maßgeschneidertes Durchflusszytometer und die stetig wachsende OBIS-Laserserie als erfolgreiche Kombination erwiesen hätten und bereits umfangreiche Daten für ihre Stoffwechselanalysen und ihre FRET-Arbeiten geliefert hätten.

Im Zusammenhang mit der Stoffwechselanalyse führte sie das Beispiel von NADH an, bei dem die gemessene Fluoreszenzlebensdauer davon abhängt, ob sich dieser Stoffwechselprodukt in der untersuchten Zelle überwiegend in gebundener oder ungebundener Form vorfindet. Dies hängt damit zusammen, wie die Zelle ATP produziert, ein hochenergetisches Molekül, das die meisten Zellaktivitäten antreibt. In normalen Zellen wird ATP hauptsächlich durch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) erzeugt. In vielen Arten von Krebszellen spielt jedoch die Glykolyse eine größere Rolle bei der ATP-Produktion, und die OXPHOS-Kapazität ist verringert. Daher kann das Team um Houston die NADH-Lebensdauer als quantitativen Indikator nutzen, um die Reaktion der Zellen auf neue Therapien zu messen.

Das Team nutzt das System zudem zur schnellen Erfassung quantitativer FRET-Daten. Derzeit analysieren sie diese Daten, um ein besseres Verständnis der Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erlangen, Proteinkonformationen zu untersuchen und die Funktionsweise von Enzymen zu erforschen. Houston merkt an: „Wir können beispielsweise beobachten, ob sich der Donor-Fluoreszenzfarbstoff im Quenched-Zustand befindet. Außerdem können wir die Emissionen von Donor und Akzeptor erfassen. Ebenso können diese Daten Aufschluss über die Wirksamkeit von Krebsbehandlungen geben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der OBIS-Laser und unser Hochdurchsatz-Zellanalysator tatsächlich eine Fülle von Daten liefern.“

Literaturverzeichnis:

1. J. Sambrano, F. Rodriguez, J. Martin und J. P. Houston, „Toward the Development of an On-Chip Acoustic Focusing Fluorescence Lifetime Flow Cytometer“, Frontiers in Physics, 2021, 9:253 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.647985
2. A. Bitton, J. Sambrano, S. Valentino und J. P. Houston, „Ein Überblick über neue Hochdurchsatzmethoden zur Messung der Fluoreszenzlebensdauer in Zellen und Geweben“, Frontiers in Physics, 2021, 9:163 https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphy.2021.648553
3. K. Nichani, J. Li, M. Suzuki und J. P. Houston, „Bewertung der Caspase-3-Aktivität während der Apoptose mittels zytometrischer Messungen auf Basis der Fluoreszenzlebensdauer und Phasoranalysen“, Cytometry A, 2020, 97(12):1265–1275; PMC7738394  
4. F. Alturkistany, K. Nichani, K. D. Houston und J. P. Houston, „Fluoreszenzlebensdauerverschiebungen von NAD(P)H während der Apoptose, gemessen mittels zeitaufgelöster Durchflusszytometrie“, Cytometry A 2019; 95(1):70–79 PMC6587805 

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