Weißbuch
Hochstabile Femtosekundenverstärker ermöglichen eine hohe Datendurchsatzrate bei der zweidimensionalen Infrarotspektroskopie zur Untersuchung von Biofilmen und Tensiden
Überblick
Forscher aus dem Labor von Prof. Carlos Baiz (Universität von Texas in Austin)untersuchen die Dynamik von hydrophil-hydrophoben Grenzflächen, um die Funktionsweise von Biofilmen und industriellen Tensiden besser zu verstehen. Sie nutzen ein zweidimensionales Infrarotspektrometer, das aufAstrella basiert. Dieses System ist nicht nur einfach zu bedienen und äußerst stabil, sondern auch hocheffizient und liefert eine große Menge an experimentellen Daten.
Biologische Membranen in der Natur und industrielle Tenside
Professor Baiz erläutert seine Forschungsmotivation: „Die traditionelle Forschung zu Tensiden und Lipidmembranen konzentriert sich stets auf einen einzigen Typ. Die Ergebnisse dieser traditionellen Forschung lassen sich nicht vollständig auf die biologischen Membranen in der Natur übertragen. So enthalten biologische Membranen beispielsweise Hunderte oder sogar Tausende verschiedener Lipide. Wir wissen heute, dass die Natur dazu neigt, sich in Richtung höherer Effizienz zu entwickeln, sodass diese unerwartete chemische Vielfalt zweifellos einen wichtigen Zweck erfüllt. Wir haben untersucht, welche Rolle die Heterogenität der Membranen bei der Faltung von Proteinen spielt, die die Zellfunktionen steuern.“ Er fügte hinzu, dass eine ähnliche chemische Vielfalt auch im Bereich der industriellen Tenside existiere, die beispielsweise zur Ölgewinnung und Schmierung eingesetzt werden. Unabhängig davon, ob diese Tenside aus petrochemischen oder biologischen Ressourcen (wie Palmöl) stammen, werden sie anhand ihrer Molekülkettenlänge, ihrer funktionellen Gruppen und anderer Merkmale charakterisiert.
„Die Prinzipien der zweidimensionalen Spektroskopie sind leicht zu verstehen, ihre Umsetzung ist jedoch oft sehr komplex.“
Die besonderen Möglichkeiten der zweidimensionalen Infrarotspektroskopie
Die zweidimensionale Infrarotspektroskopie isteines der Instrumente, die die Baiz-Forschungsgruppe in ihrer Arbeit regelmäßig einsetzt. Das Prinzip der zweidimensionalen Spektroskopie ist leicht zu verstehen, ihre Umsetzung ist jedoch oft sehr komplex. Bei der herkömmlichen (eindimensionalen) Infrarot-Absorptionsspektroskopie werden die Absorptionspeaks der Probe bei verschiedenen Frequenzen üblicherweise mit einem FTIR-Spektrometer (Fourier-Transform-Infrarotspektrometer) gemessen. Jeder Absorptionspeak entspricht einer bestimmten Molekülschwingung. Im zweidimensionalen Infrarotspektrum werden die Absorptionspeaks der Probe mithilfe von zwei Infrarotquellen (sogenanntem Pumplicht und Detektionslicht) gemessen. Die Daten werden dann als zweidimensionales Konturdiagramm mit zwei Frequenzachsen dargestellt. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, steht die Farbintensität für die Signalstärke. [1]
Warum? Lässt sich mit dieser komplexen experimentellen Methode etwas ermitteln, was mit anderen Methoden nicht messbar ist? Das Vorhandensein von Nicht-Diagonalen deutet darauf hin, dass es sich bei diesen beiden Molekülschwingungen um gekoppelte Schwingungen handelt (die sich ein oder mehrere Atome teilen oder durch eine bestimmte chemische Wechselwirkung eng miteinander verbunden sind). So lassen sich beispielsweise aus der Peakform gleichmäßige und ungleichmäßige Verbreiterungskomponenten ableiten, die wiederum Aufschluss über die dynamischen Wechselwirkungen des Moleküls mit seiner Umgebung geben. Durch Modellierung lassen sich zudem weitere, detailliertere Informationen gewinnen.
Obwohl die Daten im Frequenzbereich dargestellt werden, werden die meisten zweidimensionalen Spektralmessungen im Zeitbereich unter Verwendung ultraschneller Laserpulse durchgeführt, wie in Abbildung 1 dargestellt: Die Probe wird durch zwei Femtosekunden-Pumpimpulse angeregt, die die Frequenzen von Interesse enthalten. Anschließend wird die Verzögerung zwischen den beiden Pumpimpulsen wiederholt abgetastet und der Detektionsimpuls in den Frequenzbereich Fourier-transformiert. (ähnlich wie bei der Fourier-NMR). Der Detektionspuls ist ebenfalls ein breitbandiger Femtosekundenpuls, der alle interessierenden Frequenzen enthält. Nachdem dieser Puls die Probe durchlaufen hat, wird er auf einem Monochromator aufgeteilt, um seine Frequenz zu messen. Da das Spektrum mit Laserpulsen gemessen wird, kann die Verzögerung zwischen Pump- und Detektionspuls gesteuert werden, um verschiedene Einflussgrößen wie beispielsweise die Kohärenzzeit zu untersuchen.
Abb. 1: Wie durch zweidimensionale Infrarotspektroskopie gemessen wurde, lösen zwei breitbandige Pumpimpulse im mittleren Infrarotbereich Schwingungskohärenz in der Probe aus. Nach einer kurzen Verzögerung wird ein dritter breitbandiger Impuls angelegt, um ein Signal dritter Ordnung zu erzeugen. Bild: Baiz-Labor.
Ein vielseitiges und stabiles Versuchssystem
Baiz merkte an: „Die zweidimensionale Infrarotspektroskopie hat sich als hervorragende Methode zur Untersuchung der Dynamik von Wasserstoffbrückenbindungen in Lipidmembranen bewährt. Die Unterschiede zwischen hydrophilen und hydrophoben Bereichen bestimmen die Eigenschaften der Grenzfläche, und im Vergleich zum Hauptvolumen sind Wasserstoffbrückenbindungen an der Grenzfläche leichter aufzubrechen.“ Baiz fügte hinzu, dass ein weiterer Vorteil der zweidimensionalen Infrarotspektroskopie in seiner Forschung darin bestehe, dass man relativ starke Signale aus den Streck-Schwingungen der Karbonylgruppen (C=O) erhalten könne. Die meisten gängigen Lipide verfügen über diese Carbonylgruppen, die für die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit Wasser entscheidend sind, weshalb sich diese Technik hervorragend für die Untersuchung verschiedener Lipide eignet. [2-3]
Als Laserquelle in dieser zweidimensionalen Infrarotanlage kommt der „Astrella“Coherent zum Einsatz, Astrellaabstimmbarer optisch-parametrischer Verstärker (Coherent „TOPAS Prime“ mit NDFG-Funktion). Der Astrella Laserverstärker Astrella erzeugt 100-fs-Pulse mit einer Mittenwellenlänge von etwa 800 nm. Die Wellenlänge des Laserpulses kann über den gesamten mittleren Infrarotbereich hinweg abgestimmt werden. In der Baiz-Anlage wird sie üblicherweise auf eine Mittenwellenlänge zwischen 5,7 und 6,2 Mikrometer abgestimmt, was einer Frequenz von 1750–1580 cm-1 entspricht, um den Karbonyl-Streck-Schwingungen in Lipiden und Proteinen zu entsprechen. Die Pulsbreite von 100 fs bietet einen ausreichenden Spektralbereich, um sowohl Lipidester-Carbonylverbindungen als auch Proteinamid-Carbonylverbindungen gleichzeitig zu detektieren.
„Zweidimensionales Infrarotlicht hat sich als hervorragende Methode zur Untersuchung der Dynamik von Wasserstoffbrückenbindungen in Lipidmembranen bewährt.“
gleichzeitig räumliche und zeitliche Auflösung
Abbildung 2 zeigt schematisch die Hauptkomponenten des im Baiz-Labor verwendeten 2D-Infrarotspektrometers. In der Anfangsphase der Experimente mit ultraschneller zweidimensionaler Infrarotspektroskopie verwendeten sie maßgeschneiderte Geräte zur Erzeugung von Laserpulsen. Da diese Pulse in unterschiedlichen Strahlengängen erzeugt wurden, stellte dies eine enorme Herausforderung für die Kalibrierung der Strahlengänge dar. Heute verwenden Forscher wie Baiz kommerzielle Pulsformer (Quickshape von PhaseTech Spectroscopy Inc.), um dichte Anregungspulse zu erzeugen, wobei alle Pulse im selben Strahlengang erzeugt werden, was die Experimente erheblich vereinfacht.
Die elektronische ImpulsverzögerungsfunktionAstrella Coherent Astrella (SDG Elite) eignet sich hervorragend für Experimente wie die zweidimensionale Infrarotspektroskopie. In diesem Modus wird ein zusätzlicher UV-Laser verwendet, um chemische Reaktionen optisch auszulösen, die anschließend mittels zweidimensionaler Infrarotspektroskopie verfolgt werden. [4] Ähnlich wie bei der herkömmlichen „Pump-Probe“-Methode kann diese Methode als „UV-Pump-2D-IR-Probe“ bezeichnet werden. Die mehreren Ausgänge des SDG Elite dienen zur Synchronisation verschiedener optischer Geräte, wie in Abbildung 2 dargestellt.
Abb. 2: Schematische Darstellung der Hauptkomponenten eines 2D-Infrarotspektrometers. Astrella Coherent Astrella Vitara ,Revolution . Der Signalverzögerungsgenerator dient zur Erzeugung elektronischer Zeitimpulse zur Synchronisation des Systems. Mit freundlicher Genehmigung des Baiz-Labors.
Die Stabilität des Lasers ermöglicht eine Datenerfassung über einen langen Zeitraum
Astrella unter Einsatz von HALT-/HASS-Tests Astrella und zeichnet sich durch unübertroffene Stabilität und Zuverlässigkeit aus. HALT steht für „Highly Accelerated Life Testing“ (hochbeschleunigter Lebensdauertest), HASS für „Highly Accelerated Stress Screening“ (hochbeschleunigte Belastungsprüfung). Baiz betrachtet Astrella als entscheidenden Faktor für den Erfolg der Versuche.
Dies liegt daran, dass die Datenerfassung für jede Probe im Experiment in der Regel 16 bis 24 Stunden dauert und die Laserleistung während des gesamten Versuchs vollkommen stabil bleiben muss. Der Grund für die lange Datenerfassungszeit ist die geringe Signalstärke. Er erklärte: „Zweidimensionale Infrarotsignale sind sehr schwach, da die Schwingungsintensität bei Infrarotübergängen in der Regel weit unter der von Elektronenübergängen liegt.“ Zudem verwenden wir Isotopenaustausch: Wenn wir ein bestimmtes Lipid in einem heterogenen Gemisch untersuchen, markieren wir dieses Lipid mit Kohlenstoff-13, wodurch die Frequenz der C=O-Streckung verringert wird. Wenn das Ziel-Lipid also 5 % der Gesamtmenge ausmacht, führt dies zu einer weiteren Abnahme der Signalstärke. Wenn wir zeitabhängige Untersuchungen durchführen wollen, verlängert sich die Dauer des Experiments.“
Die einfache Bedienbarkeit hat die Auswirkungen der Pandemie auf das Baiz-Labor erheblich gemildert
Mehrere Studenten und Postdoktoranden des Baiz-Labors nutzen gemeinsam ein System zur zweidimensionalen Infrarotspektroskopie, was es Astrella die langfristige Zuverlässigkeit und die einfache Bedienung ebenso wichtig sind wie die Leistungsstabilität. Baiz erklärt: „Die Studierenden können das System zwei Wochen lang ununterbrochen nutzen. Damit diese Regelung reibungslos und fair umgesetzt werden kann, müssen wir die Nutzungsanforderungen sinnvoll koordinieren. Mit Astrellahaben Astrelladieses Ziel erreicht. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass der Laser rund um die Uhr, sieben Tage die Woche, ununterbrochen betrieben werden kann, ohne dass wir unerwartete Ausfälle befürchten müssen. Wir haben zudem einen zufriedenstellenden Servicevertrag abgeschlossen; obwohl die Wahrscheinlichkeit von Laserproblemen sehr gering ist, erhalten wir bei jedem auftretenden Problem sofort Unterstützung“, so Baiz.Astrella ermögliche esAstrella Studierenden, ihre gesamte Energie auf ihre Experimente zu konzentrieren, ohne sich um den Laser sorgen zu müssen. Während der Pandemie im Jahr 2020 war dies besonders wichtig, um die Effizienz im Labor sicherzustellen. Er merkt an: „Die Universität hat die Nutzung der Labore auf jeweils eine Person beschränkt. Daher mussten Studierende in den unteren Semestern, die noch wenig Erfahrung mit ultraschnellem Laserverstärkern hatten, ohne direkte Hilfe oder Aufsicht selbstständig arbeiten. Diese Personalbeschränkungen haben jedoch die Effizienz unseres Labors nicht beeinträchtigt – allein im Jahr 2020 haben wir 10 Artikel veröffentlicht.“
Die einzigartigen Erkenntnisse aus diesen zweidimensionalen Infrarotuntersuchungen
Abbildung 3 zeigt einige spannende Ergebnisse aus zweidimensionalen Infrarotspektroskopie-Messungen, die den Simulationsprozess von in Lipidmembranen eingebetteten Proteinen veranschaulichen. Nach gängiger Auffassung schließt eine hydrophobe innere Struktur Wasser normalerweise aus. Daten aus isotopenmarkierten zweidimensionalen Infrarotspektroskopie-Experimenten deuten jedoch auf eine signifikante Wasserdurchdringung im Membrankern hin. Dieses Bild stammt aus einer molekulardynamischen (MD) Simulation eines amphiphilen Polypeptids in der Membran. Wir stellen fest, dass Wassermoleküle bereits in einer Tiefe von etwa 1 nm in hydrophoben (Acylketten-)Bereichen Wasserstoffbrückenbindungen mit der Hauptkette eingehen können. Zur besseren Veranschaulichung wurden die umgebenden Lipide als halbtransparent dargestellt, sodass nur die Wassermoleküle um das Polypeptid herum sichtbar sind. Die durchschnittliche Position der Lipidköpfe ist durch gestrichelte Linien gekennzeichnet.
„Die Universität schreibt vor, dass jeweils nur eine Person im Labor arbeiten darf. Daher müssen Studierende in den unteren Semestern, die noch wenig Erfahrung im Umgang mit ultraschnellem Laserverstärkern haben, selbstständig und ohne direkte Hilfe oder Aufsicht arbeiten.“
Abb. 3: Wasserpermeation in einer hydrophoben Membranumgebung.
Mit freundlicher Genehmigung des Baiz-Labors.
Zusammenfassung
Die zweidimensionale Infrarotspektroskopie isteine leistungsstarke Technik zur Untersuchung chemischer Einfachbindungen. Dank der zunehmenden Einfachheit der Technik und der verbesserten Zuverlässigkeit der Systeme –insbesonderedurch die Entwicklungintegrierter, vollautomatischer Ultrakurzpulslaser– können Forschungslabore diese Methode nun als bedarfsorientierte Analysemethode einsetzen, die dieselbe Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit bietet wie etablierte Standardverfahren wie die FTIR-Spektroskopie.
Literaturverzeichnis
[1] Flanagan, Jennifer C., Mason L. Valentine und Carlos R. Baiz.Ultrafast at Lipid–Water Interfaces.“ Accounts of chemical research 53.9 (2020): 1860–1868.
[2] Flanagan, Jennifer C., Alfredo E. Cardenas und Carlos R. Baiz.Ultrafast of Lipid–Water Interfaces: Transmembrane Crowding Drives H-Bond Dynamics.“ The Journal of Physical Chemistry Letters 11.10 (2020): 4093–4098.
[3] Flanagan, Jennifer C. und Carlos R. Baiz. „Ortsspezifische Peptidsonden erkennen in einer Lipidmembran verborgenes Wasser.“ Biophysical Journal 116.9 (2019): 1692–1700.
[4] Flanagan, Jennifer C. und Carlos R. Baiz.