Weißbuch
Lösungen zur Lasermodulation für die Zwei-Photonen-Mikroskopie
综述<
Seit der Veröffentlichung der bahnbrechenden Arbeit über die Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (Dunk et al., 1990) im Jahr 1990 hat diese Technik von den enormen Fortschritten in der Lasertechnik profitiert. Diese Entwicklungen haben den Einzug dieser ursprünglich in physikalischen Labors entwickelten Technik in die Zellbiologie, die Krankheitsforschung und die bildgebende Neurowissenschaft weiter vorangetrieben.
Monolithische, abstimmbare Titan-Saphir-Laser leiteten diesen Trend um das Jahr 2001 ein. Einige Jahre später wurden diese Laser um eine automatische Dispersionssteuerung erweitert, um die Pulsdauer auf der Probenebene des Mikroskops zu optimieren. Da sich die Detektionsimpulse, die bei Wellenlängen oberhalb der Obergrenzevon Titan-Saphir-Lasernangeregt werden können, weiterentwickelten und effizienter wurden, wandten sich Laserhersteller ab 2010 optischen parametrischen Oszillatoren zu, um den Anforderungen nach mehrfarbigen Dimensionen, tieferer Bildgebung und geringerer Lichtschädigung gerecht zu werden.
In diesem Artikel werden wir die nächste Phase dieser Entwicklung erörtern, nämlich die Integration der schnellen Leistungsmodulation in Lasersysteme, und darlegen, wie diese Phase zu kürzeren Rüstzeiten, höchster Leistung und niedrigeren Betriebskosten führen wird.
„Die Integration einer schnellen Leistungsmodulation in Lasersysteme verkürzt die Einrichtungszeit, steigert die Leistung und senkt die Betriebskosten.“
Anforderungen an die Laserleistungssteuerung in der Zwei-Photonen-Mikroskopie
Bei den einfachsten Mikroskopen lässt sich die Laserleistung durch Hinzufügen eines Phasenverzögerungsfilters und eines Polarisationsanalysators stufenlos regeln. Durch Drehen des Phasenplattchens kann die Durchlässigkeit des Lasers durch den Analysator in der Regel von 0,2 % auf etwa 99 % verändert werden. Beispielsweise kann dieser Vorgang mittels eines elektrisch angetriebenen Phasenplattchens die Leistung in der Bildebene des Mikroskops automatisch verändern, um den integrierten Fokusfluss in verschiedenen Tiefenebenen auszugleichen.
Allerdings erfordern die meisten modernen laserabgetasteten Zwei-Photonen-Mikroskope schnellere Modulationsgeschwindigkeiten. Bei Anwendungen mit Gitterlaserabtastung beispielsweise, bei denen die Datenerfassung nur in einer Richtung erfolgen soll, muss der Laser während des „Back-Bias-Betriebs“ ausgeblendet werden, um unerwünschte Fluoreszenzanregung oder Photobleichung zu vermeiden. Bei resonanten Spiegeltastern können die resultierenden Anstiegs- und Abfallzeiten bis auf wenige Mikrosekunden betragen. In diesem Bereich müssen Methoden der Lichtmodulation in Betracht gezogen werden.
Lichtmodulation
Elektrooptische Modulatoren (EOM) nutzen den Pockels-Effekt, um die Laserleistung durch Einbringen einer Phasenverzögerung in den Lichtstrahl zu modulieren. In elektrooptischen Modulatoren wird durch Anlegen eines elektrischen Feldes Doppelbrechung in einem nicht zentralsymmetrischen Kristall induziert. Wie bisher wird für den Aufbau des Modulators ein Polarisationsanalysator verwendet.
Die Pockels-Zelle kann in einer vertikalen Anregungsgeometrie angeordnet werden, um größere Strahlen mit relativ kurzen Kristallen aufzunehmen. In diesem Fall beträgt die typische ½-Wellen-Spannung (d. h. die Spannung, die für eine Polarisationsdrehung um 90 Grad erforderlich ist) etwa 6 kV, was bei der Geschwindigkeit und der Einschaltdauer eines 2P-Mikroskops nur schwer zu erreichen ist. Daher verwenden die meisten Bildgebungskonfigurationen eine Geometrie mit transversalem elektrischem Feld und längere Kristalle, was die Halbwellenspannung deutlich senkt. Die Kristalle werden üblicherweise in zwei oder mehr Reihenanordnungen eingesetzt, die relativ zueinander gedreht sind, um die erforderliche Schaltspannung weiter zu senken und thermische Belastungseffekte auszugleichen.
Es ist darauf zu achten, dass der Impulskontrast (das Verhältnis zwischen minimaler und maximaler Sendeleistung) durch Kristallkalibrierung und Anpassung der Offset-Spannung optimiert wird, um einen hervorragenden Bildkontrast zu erzielen.
Abb. 1: Vereinfachte Darstellung des Betriebs einer lateralen Pockels-Zelle. Die Durchlässigkeit durch den Analysator wird durch Anpassung des angelegten elektrischen Feldes moduliert.
Da die Puckels-Box relativ einfach aufgebaut ist, findet sie in der Zwei-Photonen-Mikroskopie breite Anwendung und eignet sich besonders für selbstgebaute Zwei-Photonen-Systeme, die mit gängigen Laserwellenlängen betrieben werden.
So bietet beispielsweise eine Puckel-Box aus Kaliumdideuterophosphat (KD*P) hervorragende Transmissions-, Geschwindigkeits- und Kontrasteigenschaften für die Zwei-Photonen-Bildgebung bei 1100 nm und ermöglicht den Einsatz mit moderater Laserleistung. Darüber hinaus weist KD*P eine sehr geringe Gruppengeschwindigkeitsdispersion auf, wodurch die Gruppendispersion (GDD) deutlich reduziert wird. Für ultrakurze Laser ohne Dispersionskompensation und mit begrenztem Wellenlängenabstimmbereich (z. B. Titan-Saphir-Laser) ist die KD*P-Pockels-Box eine gute Wahl.
Abb. 2: Typische Anordnung einer Pockels-Box in einem Zwei-Photonen-Mikroskop . Der EOM befindet sich rechts unten vom Benutzer. Foto mit freundlicher Genehmigung des Packer-Labors der Universität Oxford, Großbritannien.
Ton- und Lichtmodulation
Ein akustisch-optischer Modulator (AOM) besteht aus einem transparenten Kristall oder Glas, auf dem ein piezoelektrischer Wandler angebracht ist. Durch die an den Wandler angelegten Hochfrequenzwellen (HF) werden Schallwellen induziert, die den Kristall in Schwingung versetzen und so ein Brechungsindexgitter erzeugen. Das durch den Kristall hindurchtretende Licht unterliegt dabei der Bragg-Beugung.
Die erreichbare Anstiegs-/Abfallzeit ist proportional zur Zeit, die der Schallstrahl benötigt, um den Laserstrahl zu durchqueren; daher lässt sie sich durch Verringerung der Strahlbreite im Kristall optimieren.
Die Auflösungsfähigkeit und das Kontrastverhältnis werden durch den Trennungswinkel (θS) zwischen dem nullten und dem ersten Beugungspol sowie durch den Abstand zur betrachteten Arbeitsebene definiert.
„Das Aufkommen von monolithischen, breit abstimmbaren Lasern mit Wellenlängen von etwa 680 bis 1300 nm und einer Leistung von über 2 W erfordert die Einführung eines neuen Mechanismus für die Lasermodulation und die Integration.“
Das in der Zwei-Photonen-Mikroskopie am häufigsten verwendete Material für AOMs ist Tellurdioxid (TeO₂). Dieses Material zeichnet sich durch eine hervorragende Beugungseffizienz und eine hohe Leistungsfähigkeit über einen breiten Wellenlängenbereich aus. Bei einer moderaten HF-Leistung von etwa 30 dBm lässt sich eine hohe Durchlässigkeit erzielen.
TeO₂-AOMs werden üblicherweise in einem Bragg-Interferenzbereich angeordnet, der eine hervorragende Beugungseffizienz erster Ordnung bietet und höhere Ordnungen vollständig unterdrückt. Bitte beachten Sie, dass für eine hohe Effizienz bei extrem niedriger HF-Leistung Kristalle mit einer Länge von mehr als 1 cm erforderlich sind, was zu einer nicht zu vernachlässigenden Gruppenlaufzeitdispersion (GDD) führt. Unter Berücksichtigung der Dispersion anderer nachgeschalteter optischer Komponenten, insbesondere des Objektivs, können AOM-basierte Mikroskopsysteme von der Kombination mit einem Laser mit Dispersionsvorausgleich profitieren, um möglichst kurze Impulse in der Probenebene aufrechtzuerhalten.
Der Einsatz von AOMs in abstimmbaren Lasern erfordert eine sorgfältige Auslegung der Optik und der Steuerelektronik. Da der Ablenkwinkel (θS) von der HF-Ansteuerfrequenz (d. h. der Gitterperiode) und der Laserwellenlänge abhängt, muss die HF-Ansteuerfrequenz sorgfältig kalibriert werden, um sicherzustellen, dass sich die Ausrichtung bei der Abstimmung der Laserwellenlänge nur geringfügig ändert. Darüber hinaus sollte bei verschiedenen HF-Leistungen eine hohe Beugungseffizienz für unterschiedliche Wellenlängen erreicht werden. Trotz der hervorragenden Leistungsmerkmale von AOMs ist die Integration aufgrund der Notwendigkeit einer sorgfältigen Steuerung von HF-Frequenz und -Leistung sowie der Bewältigung relativ großer GVD in abstimmbaren Abbildungssystemen sehr aufwendig, was bislang den Einsatz von AOMs in vielen DIY- und kundenspezifischen Anwendungen eingeschränkt hat.
Modulation breitbandiger abstimmbarer Laser
Das Aufkommen von monolithischen, breit abstimmbaren Lasern mit Wellenlängen von etwa 680 bis 1300 nm und einer Leistung von über 2 W erfordert die Einführung eines neuen Mechanismus für die Lasermodulation und die Integration.
Die üblicherweise verwendeten KD*P-Pockels-Kästen zeigen bei hohen Leistungen einen thermischen Haloeffekt, der sich nachteilig auf die Strahlausrichtung, die Integrität der Strahltaille und die Lebensdauer auswirkt. Längere Wellenlängen bringen zudem höhere Ansteuerungsspannungen und Herausforderungen hinsichtlich des Kontrastverhältnisses mit sich. Lithiumtantalat ist ein geeignetes EOM-Material, das für einen breiteren Abstimmbereich genutzt werden kann. Bei kommerziellen Geräten liegt die Gruppenlaufzeitdispersion jedoch über dem korrigierbaren Bereich von dispersionskompensierten Lasern, was zu längeren Pulsen und einer geringeren Spitzenleistung führt und eine effiziente Abbildung beeinträchtigt.
Wie bereits erwähnt, erfordern AOM-basierte Lösungen trotz potenzieller Kosten- und Leistungsvorteile für ihre Implementierung ein hohes Maß an Fachwissen in den Bereichen Optikdesign und elektronische Steuerung, über das viele Einrichtungen für die biologische Bildgebung in der Regel nicht verfügen. Dennoch können AOM-Lösungen als integrierte Lösung bei bestimmten Mikroskopherstellern erworben werden.
Im Jahr 2017Coherent , dass eine Komplettlösung,Coherent AOM-Modulation und LaserquelleCoherent , sowohl für Anwender als auch für die Mikroskopiebranche von Vorteil sein würde. Auf der Grundlage des Fachwissens, das bei der Entwicklung integrierter AOM-Lösungen für industrielle ultraschnelle Bearbeitungslaser gesammelt wurde,Coherent Power Control“ (TPC) als vollständig integrierte Option für Chameleon .
自动免持包装中的 Chameleon Discovery NX 上提供的全功率控制可在 660 nm 至 1320 nm 的整个全倍频程调谐范围内提供高对比度 (>1000:1) 和高速（上升时间 <1 μs）调制。
Abb. 3: TPC und typische maximale AusgangsleistungChameleon NX nach Modulation.
Alle aufwendigen Anforderungen an die HF-Frequenz- und Leistungskalibrierung sowie -anpassung sind bereits im Laser selbst programmiert, sodass der Anwender oder der Mikroskopintegrator lediglich die gewünschte Wellenlänge und Leistungsstufe angeben muss.
Da AOMs sehr kosteneffizient sind, ist der Ausgang des Chameleon NX TPC mit einer festen Wellenlänge von 1040 nm zudem mit einem eigenen, speziell dafür entwickelten AOM und Treiber ausgestattet.
Die Steuerung erfolgt bequem über serielle/USB-Befehle oder schnelle analoge Steuereingänge.
Abbildung 4: Die Ausgangsleistung kann direkt über die bereitgestellte Benutzeroberfläche geändert werden,
oder der Benutzer kann
zusätzliche schnelle analoge Eingänge bereitstellen.
Zukunftstrends
Da sich der Anwendungsbereich der Zwei-Photonen-Bildgebung zunehmend auf OEM- und präklinische Anwendungen ausweitet, steigt die Nachfrage nach kostengünstigen Einwellenlängen-Femtosekunden-Lichtquellen. Axon ultraschnellen Axon erfüllen diese Anforderungen in vollem Umfang.
Bereits in der Phase der Produktkonzeption wurden die TPC-Funktionen in Axon integriert, Axon den Einsatz Axon neuen Mikroskopdesigns und -anwendungen zu vereinfachen. Dies bietet ultimativen Integrationskomfort für Anwendungen, bei denen Zwei-Photonen-Mikroskopsysteme nicht nur als reine Forschungsgeräte, sondern als Teil von diagnostischen, klinischen oder Hochdurchsatz-Screening-Systemen zum Einsatz kommen.
In der Spitzenforschung der Neurowissenschaften spielen Hochleistungslaser eine entscheidende Rolle bei der volloptischen In-vivo-Bildgebung unter Verwendung optogenetischer Stimulation (Yuste, 2012). Eine Laserleistung von mehreren zehn Watt wird über einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) in einzelne, feine Lichtstrahlen aufgeteilt, mit denen Dutzende oder Hunderte von Neuronen separat adressiert werden können. Diese optische Steuerungsmethode erfordert kurze und anpassbare Impulsfolgen. Dank ihres Vollfaser-Designs bieten Hochleistungsfaserlaser wieCoherent Monaco die für solche Anwendungen erforderliche Flexibilität. Die daraus resultierenden Anforderungen an hohe Durchschnittsleistung und hohe Laserenergie sowie die Notwendigkeit, die Stimulationsstrahlen im Submillisekundenbereich zu schalten, stellen die bestehende Pockels-Box-Technologie vor konkrete Herausforderungen. Zu diesem Zweck wurde die AOM-Technologie vollständig in Monaco integriert Monaco eine präzise Impulssteuerung, ein vereinfachtes Mikroskopdesign und eine höhere Zuverlässigkeit des Bildgebungssystems zu ermöglichen.
Abb. 5: Beispiel für eine kontrastreiche Kalzium-Bildgebung mit hoher Bildrate, ermöglicht durch Discovery TPC. (Überlagerungsbild von RCaMP1.07-exprimierenden Neuronen (rot) bei 1100-nm-Laseranregung und GCaMP6s-exprimierenden Astrozyten (grün) bei 940-nm-Laseranregung in vivo bei Mäusen. Anregungsquelle: Chameleon TPC. Bild mit freundlicher Genehmigung des Weber-Labors der Universität Zürich).
Abbildung 6: Alle Axon mit der optionalen TPC-Funktion Axon .
Abbildung 7: Kombinierter EinsatzChameleon NX TPC und Axon TPC. Das TPC vereinfacht die optische Anordnung und spart wertvollen Platz auf dem Objekttisch. Foto: Neil Merovitch, Toronto Children’s Hospital.
Zusammenfassung
In dieser technischen Beschreibung erörtern wir zwei Hauptmethoden zur Modulation der Laserausgangsleistung von Femtosekundenlasern, die in der Zwei-Photonen-Mikroskopie zum Einsatz kommen: die elektrooptische Modulation und die akustooptische Modulation. Bislang haben sich die meisten „Selbstbauer“ für die EOM entschieden, da der Einsatz dieser Hochspannungsgeräte im Strahlengang relativ einfach ist. Mikroskophersteller integrieren ihre EOM- oder AOM-Komponenten teilweise in ihre Laserübertragungssysteme und nutzen ihre Softwarearchitektur, um sowohl das Mikroskop als auch den Laser zu steuern. Coherent Hochleistungs-Faserlasern, die für den 24/7-Betrieb ausgelegt sind, und hat erkannt, dass die Vorteile des AOM-Ansatzes in Bezug auf Größe, Kosten, Geschwindigkeit und Gesamtleistung auch den Anforderungen von Zwei-Photonen-Bildgebungsanwendungen gerecht werden. Ob für fortschrittliche neurowissenschaftliche Anwendungen oder medizinische Diagnostik – durch die Integration der komplexen Steuerung des AOM in Discovery NX,Axon und Monaco , können Zweiphotonen-Anwender (Selbstbauer und Mikroskophersteller) von einer erheblich vereinfachten und leicht zu steuernden optischen Anordnung profitieren.