Analyse von Krebszellen – ein neuer Träger

Was ist Durchflusszytometrie?

In einem Durchflusszytometer werden Zellen oder andere biologische Partikel in einer Reihe angeordnet und strömen mit hoher Geschwindigkeit durch die Interaktionszone, wo sie von einem oder mehreren fokussierten Laserstrahlen angeregt werden. Das Gerät erfasst für jede Zelle die dabei entstehende Intensität der angeregten Fluoreszenz, in der Regel die Intensität des Streulichts.In Zählgeräten ermöglicht diese Methode die schnelle Analyse großer Zellmengen, beispielsweise um den prozentualen Anteil eines bestimmten Zelltyps oder mehrerer Zelltypen zu ermitteln. Ist das Gerät mit einer Sortierfunktion ausgestattet, lenkt es die Zielzellen anhand ihrer Fluoreszenz- bzw. Streueigenschaften mittels eines elektrischen Feldes in einen Behälter um, wodurch diese Zellen einzeln gesammelt werden.

Die Durchflusszytometrie zeichnet sich durch ihre Schnelligkeit aus und eignet sich für viele verschiedene Anwendungsbereiche. Sie wird im medizinischen Bereich häufig zur Analyse von Blutzellen eingesetzt, beispielsweise für das große Blutbild (CBC). Darüber hinaus wird sie für experimentelle Forschungen und Arzneimitteltests genutzt, wobei sie in der Regel zur Analyse von Säugetierzellen außerhalb des Blutes eingesetzt wird. Manchmal wird sie auch zur Untersuchung von Mikroorganismen im Meerwasser verwendet und ermöglicht die Geschlechtssortierung von Spermien bei Nutztieren, was dazu beiträgt, dass Kühe weibliche Nachkommen zur Welt bringen.

Verwendung weiterer Wellenlängen und UV-Wellenlängen

Obwohl die Durchflusszytometrie bereits seit Jahrzehnten existiert, ist sie nach wie vor ein dynamisches Forschungsgebiet. „„Multiparameter-Durchflusszytometer“ sind ein Entwicklungstrend; diese Geräte nutzen bis zu 12 verschiedene Laserwellenlängen, um unterschiedliche Parameter in den Zellen zu analysieren. Laserhersteller leisten einen wichtigen Beitrag zu dieser Entwicklung, indem sie universelle Laser mit neuen Wellenlängen anbieten und Laser mit mehreren Wellenlängen in einer integrierten Lichtquelle vereinen. (Coherent verkörpert diese beidenEntwicklungstrends.)

Ein weiterer Trend ist der zunehmende Einsatz von UV-Wellenlängen. Mit UV-Wellenlängen lassen sich mehr Parameter erfassen, und sie ermöglichen zudem die Erfassung der spontanen Fluoreszenz. Damit ist gemeint, dass bestimmte in Zellen vorkommende Substanzen von Natur aus fluoreszieren, ohne dass Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Zusatzstoffe verwendet werden. Zu diesen Substanzen gehören einige wichtige Stoffwechselprodukte wie NAD(P)H und FAD.

Forscher erzielen damit einen neuen Durchbruch

In derzuvor vorgestellten Coherent haben wir das Forschungsteam von Prof. Jessica Houston von der New Mexico State University vorgestellt, das Pionierarbeit bei der Entwicklung und Anwendung der zeitaufgelösten Durchflusszytometrie geleistet hat. Wir haben erörtert, warum sie NAD(P)H und FAD untersuchen; diese Zellen lassen sich nicht nur zählen, sondern es lässt sich auch ihr Stoffwechselzustand bestimmen. Dr. Houston erklärt: „Die meisten Durchflusszytometrie-Messungen basieren auf der Intensität des Fluoreszenzsignals. Es gibt jedoch viele Faktoren, die diese Messmethode stören und zu Fehlern führen können, darunter die Menge an Fluoreszenzfarbstoff, die an die Zelloberfläche oder ins Zellinnere bindet.Wir haben uns außerdem entschlossen, die Abklingzeit des Fluoreszenzsignals jeder einzelnen Zelle zu messen. Die Lebensdauer hängt nicht von der Konzentration ab, sondern vom chemischen Zustand des Fluoreszenzfarbstoffs oder des natürlichen (endogenen) Materials, das für die spontane Fluoreszenz verantwortlich ist. Die endogene Fluoreszenz liefert uns einzigartige Informationen über den Stoffwechselzustand der Zelle. Wir können diese Informationen beispielsweise nutzen, um zu beurteilen, ob es sich bei einer Zelle um eine normale Zelle oder um eine transformierte Zelle (Krebszelle) handelt.“

Sie interessierten sich besonders für NAD(P)H und FAD, da die Fluoreszenzlebensdauer dieser Coenzyme Aufschluss darüber gibt, ob sie an Proteine gebunden sind. Dies wiederum liefert Hinweise darauf, wie Zellen Zucker zur Energiegewinnung oxidieren, vor allem durch die sogenannten Prozesse der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse. Der Bericht zeigt,in vielen Krebszellen sowie anderen „defekten“ oder geschädigten Zellen sehr hohe Konzentrationen an „freiem“, ungebundenem NAD(P)H gemessen wurden, was darauf hindeutet, dass die Zellen Energie über den ineffizienten Prozess der „Glykolyse“ gewinnen. Das Verhältnis der optisch gemessenen FAD-Menge zur NAD(P)H-Menge steht für die Stoffwechselaktivität in der Zelle, also das Redoxverhältnis.

Tipps zum Einsatz von Dauerstrichlasern

Zunächst nutzte das Team aus Houston Laserimpulse, um zeitabhängige Daten zu erfassen.Anschließend zeichnete das Gerät den Abklingvorgang des Fluoreszenzimpulses mit einer der beiden folgenden Methoden auf. Eine Methode nutzte die Echtzeit-Abklingkurve bei ausgeschaltetem Laser, die andere das Frequenzbereichssignal bei extrem schneller wiederholter Modulation des Lasers. Das Team wählte die letztere Methode, um FAD mit einem OBIS-Laser bei einer Wellenlänge von 375 nm zu überwachen. Um jedoch das vollständige Redoxverhältnis genau zu bestimmen,müssten idealerweise sowohl FAD als auch NAD(P)H gemessen werden. Um die Fluoreszenzabklingzeit von NAD(P)H unabhängig zu messen, ist eine weitere Anregung im UV-Bereich bei etwa 349 nm erforderlich.

Die Kernkonzepte der nFLIC-Methode. Wenn Zellen einen ungleichmäßigen Strahlprofil durchqueren, steigt und fällt die Fluoreszenz. Die Fluoreszenzlebensdauer wird direkt über die Phasenverzögerung des Anregungslasers gemessen. Bild mit freundlicher Genehmigung des Houston-Labors.

Vor kurzemCoherent in Houston einen neuen OBIS-Laser mit einer Ausgangswellenlänge von 349 nmCoherent . Dieser nutzt jedoch eine andere interne Technologie als der 375-nm-Laser, weshalb die direkte Modulation nicht ganz so einfach ist.Für das Team ist dies jedoch kein Problem, da es vor einigen Jahren eine ausgeklügelte Technik namens „Non-Modulated Fluorescence Lifetime Cytometry“ (nFLIC) entwickelt hat, bei der ein Dauerstrichlaser (CW) zur Bestimmung der mittleren Fluoreszenzlebensdauer eingesetzt wird.

Abbildung 1 veranschaulicht das Funktionsprinzip. Bei einem Laser, der den Lichtstrahl im TEM00-Modus aussendet, steigt und fällt die Anregungswahrscheinlichkeit im Gaußschen Strahlprofil, wenn die Zelle den Fokus passiert. Eine von Null abweichende Fluoreszenzabklingzeit führt jedoch zu einer Fluoreszenzimpulsverzögerung (FPD). Während die Zelle den Strahl durchläuft, nimmt die Fluoreszenzintensität langsamer ab als im Gaußschen Anregungsprofil.Das Team aus Houston hat durch strenge Experimente nachgewiesen, dass die FPD die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer der Zellen effektiv charakterisieren kann.

Der neue OBIS 375 hat sich aufgrund seiner hervorragenden Strahlqualität bei den nFLIC-Untersuchungen im Labor von Houston bewährt. Professor Houston erklärt: „Erstens verfügt er über eine saubere, hervorragende TEM00-Strahlform, genau das, was wir brauchen. Außerdem ist er ein Laser mit sehr geringem Rauschen. Ebenso wichtig ist, dass Leistung, Strahlform und Strahlausrichtung sehr stabil sind. Das ist von entscheidender Bedeutung, da es die genaue Kalibrierung des Verhältnisses zwischen dem Abklingen des Fluoreszenzimpulses und der Fluoreszenzlebensdauer unter Verwendung spezieller fluoreszierender Mikrokügelchen gewährleistet.“

Resistenz von Krebszellen

Krebszellen sind ein gefürchteter Feind, da sie häufig Resistenzen gegen andere wirksame Chemotherapeutika entwickeln. Auf der CYTO 2023-Konferenz in Montreal, Kanada,hielt Samantha Valentino, eine Doktorandin aus dem Houstoner Labor, einen beeindruckenden Vortrag, in dem sie den Wert der zeitaufgelösten Durchflusszytometrie bei der Bestimmung der FAD/NADH-Fluoreszenzlebensdauer und des Redoxverhältnisses aufzeigte. Diese Methode kann als leistungsstarkes Instrument zur Überwachung der Resistenz von Brustkrebszellen gegenüber dem Chemotherapeutikum „Tamoxifen“ dienen.

Daten zur Fluoreszenzlebensdauer von MCF- und T47D-Brustkrebszellen – Vergleich zwischen empfindlichen und resistenten Zelllinien. Bild mit freundlicher Genehmigung des Houston-Labors.

Sie erklärte konkret: „Tamoxifen“ sei ein weit verbreitetes Medikament, das wirksam gegen „Östrogenrezeptor-positiven“ Brustkrebs wirke und häufig zur Linderung der Symptome eingesetzt werde. Allerdings entwickelten die Krebszellen oft innerhalb von zwei bis fünf Jahren nach Beginn der Behandlung eine Resistenz.Valentino wies zunächst darauf hin, dass das Redoxverhältnis in aggressiveren Krebszellen (wie resistenten Krebszellen) nur schwer zu messen ist. Sie untersuchte zwei verschiedene Brustkrebsarten (MCF-7 und T47D). In beiden Fällen verglich sie Tamoxifen-empfindliche Krebszelllinien mit Tamoxifen-resistenten Zelllinien. Abbildung 2 fasst die Ergebnisse zusammen undund zeigt, dass ihre Methode statistisch signifikante Unterschiede zwischen empfindlichen und resistenten Zellen misst. Es versteht sich von selbst, dass die Fähigkeit, die Resistenzmerkmale von Krebszellpopulationen schnell zu analysieren, zu einem wichtigen neuen Ansatz in der Krebsbekämpfung werden könnte: Dieser Ansatz ist sowohl für die Arzneimitteltestung und -forschung als auch für die Bereitstellung verbesserter Behandlungspläne für Patienten von entscheidender Bedeutung.

Zusammenfassung

Im Hinblick auf den Trend zur personalisierten Medizin haben sich auf laserangeregter Fluoreszenz basierende Analysetechniken (wie Durchflusszytometrie,DNA-Sequenzierung und mikroskopische Gewebebiopsie) zu immer wichtigeren Werkzeugen entwickelt, wobei die COVID-19-Pandemie diesen Trend weiter beschleunigt hat.Coherent , mit seinen Lasergeräten einen Beitrag zur Weiterentwicklung dieser Technologien zu leisten, indem diese Geräte folgende Merkmale aufweisen: eine höhere Analysegeschwindigkeit und bessere Datenqualität, geringere Anwendungshürden sowie niedrigere Gesamtbetriebskosten.

Relevante Ressourcen